前沿合作 | 基于島津MALDI-TOF技術平臺檢測7種人冠狀病毒及新型冠狀病毒分型與重要突變位點的方法研究
SARS-CoV-2變異株的出現，使全球面臨第二波冠狀病毒疾病大流行的危機
目前，已知可以感染人的冠狀病毒共有7種，分別為20世紀60年代發現的人冠狀病毒HCoV-229E和HCoV-OC43，2003年新出現的SARS冠狀病毒SARS-CoV，2004年發現的人冠狀病毒HCoV-NL63，2005年新發現的人冠狀病毒HCoV-HKU1，2012年7月在中東地區出現的MERS冠狀病毒MERS-CoV以及2019年12月下旬爆發的嚴重性呼吸系統綜合征冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。其中，2019冠狀病毒?。–oronavirus disease 2019，COVID-19）引起了全球持續地大流行。盡管全球采取了許多干預和控制措施，截至2022年1月4日，已有200多個國家受到該病毒的影響，實驗室確診的COVID-19病例人數已超過2.9億，死亡人數超過540萬。
本次研究基于島津AXIMA Performance MALDI-TOF質譜檢測平臺，旨在提供一種特異性強、靈敏度高的用于檢測7種人冠狀病毒（人冠狀病毒229E、NL63、HKU1、OC43、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2），及新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）分子分型與重要變異株的檢測方法。
島津應對策略及解決方案
通過合理選擇設計位點、適當添加修飾堿基，可以將延伸探針的質量加以區分，均勻分布于檢測范圍之內，從而達到多重檢測的目的。整個檢測反應流程分為五步（圖1）：
圖1 島津AXIMA Performance MALDI-TOF用于7種人冠狀病毒及新型冠狀病毒分型與重要突變位點的檢測流程示意圖
第一步是一步法多重PCR反應，根據待檢測位點兩端的側翼序列來設計引物與探針，在一個反應體系中實現逆轉錄PCR與多重PCR擴增反應，從而達到擴增待測位點的目的。第二步應用蝦堿性磷酸酶（Shrimp alkaline phosphatase，SAP）對上一步PCR的反應產物進行處理，消化掉剩余的脫氧核酸核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）。第三步是單堿基延伸反應。事先針對每個檢測位點設計一條短探針，探針可以結合到第一步PCR的擴增子上，同時令探針結合之后，延伸的第一個堿基就是要檢測的多態性位點。向第二步的產物中加入這些探針，使用經修飾的雙脫氧三磷酸核苷（ddNTP）作為反應底物，再配合專用的擴增酶進行反應。第四步是樹脂純化。第五步是質譜檢測。將第四步的反應產物轉移到包被基質的點樣靶板上，待樣本結晶之后，使用飛行時間質譜儀檢測延伸的單堿基質量大小，來判定檢測靶基因的有無，從而進一步判定樣本中目標病原體的有無。
本方法經特異度評估、靈敏度評估以及穩定性評估，結果如下：
●使用28種常見呼吸道病原進行本方法特異度檢測，測試結果顯示，該方法與常見呼吸道病原均無交叉反應，說明該方法具有良好的特異度；
●梯度稀釋核酸樣本，測試本方法的靈敏度，測試結果顯示本方法檢出限為250copies/mL；
●使用多個樣本檢測本方法的穩定性，檢測結果顯示，不同檢測樣本的檢測結果一致，該方法表現出良好的穩定性。
方法 · 特點
創新性地使用一步法多重PCR技術與核酸質譜檢測分析方法聯用，實現從臨床樣本核酸提取后直接進行檢測和分型，不需要額外進行RNA的逆轉錄，很大程度上縮短檢測時間和減小試劑的消耗；
與高通量測序技術相比，該方法一次性可處理和分析96或384份樣本，且可在一天內獲得7種人冠狀病毒的檢測結果，及SARS-CoV-2基因組中重要的突變信息，并對其進行分型，特別適用于大規模的流行病學研究和重要型別的監測；
該方法具有靈活易用的特點，隨著SARS-CoV-2病毒的不斷地進化和基因組新突變的產生，新出現的重要突變位點可以被納入用來設計更全面的檢測方法。
結論
島津中國創新中心與中國醫學科學院病原生物學研究所合作開發了一種基于MALDI—TOF平臺檢測7種人冠狀病毒及新型冠狀病毒分型與重要突變位點的檢測方法。利用一步法多重PCR與MOLDI-TOF質譜技術聯用來鑒定7種人冠狀病毒與新型冠狀病毒的重要突變位點。我們通過對包含新型冠狀病毒在內的7種人冠狀病毒的每一種目標病原體，選擇種間特異且種內保守的基因作為檢測靶基因，同時根據GISAID公布的用于新型冠狀病毒分型與重要突變位點檢測的重要突變位點作為靶點。針對上述檢測靶點，設計相應檢測試劑，旨在開發和評估一種可直接用于7種人冠狀病毒檢測和新型冠狀病毒分型的快速、簡便、無須測序的方法。該方法的建立為動態監測SARS-CoV-2病毒的感染和主要型別的全球流行情況提供強有力的手段。
*文中推薦技術方法方案僅用于醫學及科研人員技術交流，不作為臨床診斷依據。
*本研究的相關成果已申請國家專利（申請號：202111084113.0）。
