文獻速遞 | 美國藥典委員會發表GC-MS/MS分析6種痕量亞硝胺雜質方法的論文
藥品原料藥和制劑的生產過程中，不可避免地會產生或引入影響藥物穩定性甚至威脅人類健康的雜質，比如在血管緊張素受體拮抗劑 (ARB)、雷尼替丁及其他藥物中發現潛在致癌物-亞硝胺雜質。1987年亞硝胺類化合物（NAs）被國際癌癥研究機構（IARC）列入致癌物清單，2017年國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）評估和控制藥物中DNA反應性（致突變）雜質的ICH M7指導原則將致癌風險高的NAs列為“關注隊列”。
在酸性條件下，若仲胺、叔胺或季胺和亞硝酸鹽同時存在，則有可能形成亞硝胺。藥物原料藥生產過程中采用的起始原料、試劑、催化劑、溶劑、中間體以及被污染的設備和試劑都有可能造成亞硝胺雜質的生成。此外，藥物制劑過程中采用的輔料以及藥物因儲藏條件而發生氧化、分解等反應也會在藥物中引入亞硝胺雜質。其中有機溶劑在API生產及藥品的分離、純化過程中發揮著至關重要的作用，根據FDA（美國食品藥品監督管理局）和EMA（歐洲藥品監督管理局）的指導原則，藥品生產過程中使用的有機溶劑是亞硝胺雜質的潛在根源之一。因此對藥物及藥品生產使用有機溶劑中亞硝胺類雜質的種類、含量測定和成因分析，近年來已成為制藥行業關注的重點。
為應對亞硝胺危機，USP（美國藥典委員會）經方法測試及風險評估后建立了幾個亞硝胺參考標準，并發布了新的《美國藥典—國家處方集(USP-NF) 》通則
FDA曾報告了一種采用GC-MS/MS結合直接進樣的方法測定有機溶劑中NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA和NDBA等亞硝胺雜質，但對于未知雜質較多的商用級溶劑的分析中，對于未知雜質干擾的排除及未知雜質與亞硝胺雜質峰的分離度方面還面臨一些挑戰。基于此，USP使用島津高靈敏度GCMS-TQ8050 NX三重四極桿氣質聯用系統開發了一種高靈敏度的GC-MS/MS分析方法，用于二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和鄰二甲苯溶劑中同時測定六種亞硝胺雜質(NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA和NDBA)，并驗證了該方法的有效性。
儀器和分析條件
溶液和樣品制備
注：所有溶液均在棕色容量瓶中配制
結果與討論
1方法開發
商用溶劑中存在較多的干擾雜質以至于影響亞硝胺的準備識別，通過優化MRM離子對、碰撞能量以減少未知雜質的干擾（MRM條件優化結果見下表1），此外對柱溫程序也進行優化，并改變檢測器增益（0.8kv）以提高方法的靈敏度（相對于商用溶劑樣品濃度達到100 ppb）。同時對于樣品濃度，經測試樣品濃度為25 mg/mL時可以減少干擾并保持高的靈敏度。由于亞硝胺的原位形成，GCMS使用的高溫可能會導致亞硝胺測試結果偏高。通過空白進樣，未觀察到亞硝胺出峰位置有干擾。此外室溫下48h穩定性測試亦未發現亞硝胺雜質發生變化。
進一步使用分析級溶劑對方法進行驗證，再次證實了原FDA方法商用溶劑中未知雜質影響了分析方法的靈敏度，其中相對于100 mg/mL的樣品濃度NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA的LOQ為5 ppb，NDBA的LOQ為13 ppb。與FDA報道的方法相比，優化后的方法對不同純度溶劑樣品中亞硝胺的分析具有良好的分離度和高靈敏度。
表1 6種亞硝胺的MRM條件（離子對、CE值、掃描時間）
注：N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基乙基異丙基胺（NEIPA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）、N-亞硝基二苯胺（NDPA）、N-亞硝基二丁胺（NDBA）
2方法學驗證
用所建立的GC-MS/MS方法對二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和鄰二甲苯等商用溶劑和分析級溶劑中的6種亞硝胺進行測定，驗證標液濃度完全覆蓋FDA相關限值要求，通過色譜分離專屬性、線性、準確度、重復性、中間精密度等多個指標驗證了該方法的可靠性。驗證方法及結果分見表2和圖2 。
表2 方法學驗證程序及結果
RLL-低濃度水平加標回收率（5 ppb* (NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA)和13 ppb*(NDBA) ）
RML-中濃度水平加標回收率（1000 ppb* ）
RUL-高濃度水平加標回收率（2000 ppb*）
*：相對于100 mg/mL的樣品濃度
圖2 （A) LOQ溶液色譜圖 （0.5 ng/mL (NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDPA)和1.3 ng/mL (NDBA)）
(B) MRM-1和MRM-2提取離子色譜圖
3樣品分析
使用經驗證的方法對二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和鄰二甲苯等商用溶劑進行測試，結果發現，甲苯被550 ppb的NDEA污染，鄰二甲苯被120 ppb的NDEA和3400 ppb的NDBA污染。在上述商用溶劑和其他分析級的二氯甲烷和乙酸乙酯溶劑中未檢測到亞硝胺。
總結
溶劑在制藥工業中被廣泛用作原料藥和制劑的反應介質和其他步驟。溶劑生產和運輸過程中添加的化學品、生產過程中的污染以及溶劑回收等都是商用溶劑中亞硝胺的潛在來源。USP使用島津高靈敏度的GCMS-TQ8050 NX系統開發了在藥品生產中廣泛使用的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯和鄰二甲苯溶劑中的六種亞硝胺的高靈敏度的檢測方法，該方法對于商用級和分析級溶劑都能實現滿意的檢測效果。
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